Egzosomy to pozakomórkowe pęcherzyki uwalniane z komórek, które przenoszą białka, lipidy, RNA i DNA, umożliwiając komunikację międzykomórkową. Te nanocząsteczkowe ciała o wielkości od 30 do 150 nm przypominają cytoplazmę komórki i odgrywają różne role fizjologiczne w zdrowiu i chorobie. Odkrycie, że egzosomy zawierają funkcjonalne biomolekuły, wzbudziło zainteresowanie ich potencjalną wartością terapeutyczną i diagnostyczną. W tym wpisie na blogu omówimy najnowsze postępy w badaniach nad egzosomami oraz sposób, w jaki te pęcherzyki mogą utorować drogę dla innowacyjnych nanomedycyny.
Biogeneza i skład egzosomów
Egzosomy powstają w wyniku endocytozy, w której błona komórkowa pączkuje do wewnątrz, zamykając cytozol w pęcherzykach, które łączą się z wczesnymi endosomami. W miarę jak dojrzewające endosomy rozwijają się w ciała wielopęcherzykowe (MVB), wewnątrz gromadzą się pęcherzyki wewnątrzkomórkowe (ILV). Gdy MVB łączą się z błoną plazmatyczną, ILV są uwalniane pozakomórkowo jako egzosomy (Colombo i in., 2014). Ta endosomalna ścieżka biogenezy skutkuje egzosomami zawierającymi białka sygnaturowe (np. tetraspaniny, Alix, Tsg101), białka cytozolowe, różne gatunki RNA i lipidy przypominające komórkę macierzystą.
Kluczową cechą egzosomów jest ich udział w komunikacji międzykomórkowej. Przenosząc bioaktywne cząsteczki między komórkami, umożliwiają one zlokalizowaną i systemową wymianę danych, która wpływa na procesy fizjologiczne i patologiczne. Ładunek biomolekularny egzosomów zależy od typu i stanu komórki macierzystej. Na przykład, egzosomy pochodzące z komórek dendrytycznych zawierają kompleksy MHC-peptydowe, które aktywują limfocyty T (Théry i in., 2009). Tymczasem egzosomy pochodzące z guza zawierają onkoproteiny i materiał genetyczny, które promują angiogenezę, przerzuty i immunosupresję (Whiteside, 2016). Zdolność do izolowania egzosomów z różnych płynów biologicznych czyni je idealnymi do profilowania biomarkerów i płynnych biopsji.
Inżynieria egzosomów dla ukierunkowanego dostarczania leków
Wewnętrzna zdolność egzosomów do transportu cząsteczek między komórkami wzbudziła zainteresowanie ich inżynierią w celu ukierunkowanego dostarczania leków. Nanonośniki oparte na egzosomach oferują wiele zalet w porównaniu z istniejącymi platformami dostarczania leków (np. liposomy, nanocząstki polimerowe). Ich skład pochodzący z komórek ułatwia unikanie odporności, biodostępność i biokompatybilność. Obecność białek adhezyjnych na ich powierzchni umożliwia ukierunkowanie na konkretną komórkę. Co więcej, ich zamknięty ładunek ma zwiększone dostarczanie wewnątrzkomórkowe możliwe dzięki fuzji błonowej.
Wczesne badania potwierdzające wykonalność inżynierii egzosomów wykorzystały elektroporację lub transfekcję do załadowania małych leków, siRNA, mRNA i nanocząstek do egzosomów (Jang i in., 2013). Na przykład, egzosomy zawierające kurkuminę dostarczane doustnie modulują sygnalizację stanu zapalnego u myszy (Zhuang et al., 2011). Takie metody bezpośredniego ładowania są ograniczone pojemnością ładunku i toksycznością. Od tego czasu pojawiły się bardziej zaawansowane metody aktywnego ładowania egzosomów z większą wydajnością. Na przykład, optycznie odwracalne interakcje białko-białko zostały wykorzystane do pakowania rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 do egzosomów pochodzących z guza, umożliwiając dostarczanie maszyn do edycji genomu (Hwang i in., 2019).
Biodystrybucja egzogennie podawanych egzosomów zależy w dużej mierze od ich białek powierzchniowych. Aby osiągnąć ukierunkowane dostarczanie do określonych typów komórek, naukowcy ozdobili egzosomy docelowymi ligandami. Hybrydowe nanocząsteczki egzosomowo-liposomowe zawierające na swojej powierzchni peptyd ukierunkowany na mózg dostarczały kurkuminę przez barierę krew-mózg po wstrzyknięciu dożylnym (Haney i in., 2015). W międzyczasie, egzosomy zawierające peptyd GE11 celowały w komórki raka piersi z nadekspresją EGFR (Ohno i in., 2013). Badania te podkreślają ulepszenia dokonane w kierowaniu nośników egzosomalnych do zamierzonych miejsc działania.
Optymalizacja ładowania leków egzosomowych i celowania w komórki
Pomimo postępów, nadal istnieje kilka wyzwań związanych z wdrażaniem nanonośników egzosomowych do dostarczania leków. Brak skalowalnych metod uzyskiwania jednorodnych egzosomów klasy klinicznej o przewidywalnej farmakokinetyce ogranicza możliwości translacyjne. Jednak innowacje w oczyszczaniu, charakteryzowaniu i przechowywaniu egzosomów mają na celu przezwyciężenie wąskich gardeł w produkcji. Na przykład, izolacja oparta na filtracji z przepływem stycznym z pożywki kondycjonowanej mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pozwala uzyskać egzosomy w skali i czystości niezbędnej do testów klinicznych (Heath i in., 2018). Takie postępy w skalowalności umożliwiają dalsze etapy ładowania i bioinżynierii.
Niedawno pojawiły się różne techniki optymalizacji ładowania egzosomów lekiem przy jednoczesnym zachowaniu integralności pęcherzyków i stabilności koloidalnej. Na przykład, hydrofobowo zmodyfikowane siRNA wiążą się z lipidami błony egzosomalnej poprzez interakcje hydrofobowe, osiągając skuteczne spontaniczne ładowanie bez uszczerbku dla morfologii pęcherzyków lub biodystrybucji (Kamerkar i in., 2017). Inne grupy wykorzystały makropinocytozę, masowy proces endocytozy, do aktywnego indukowania ładowania ładunku w komórkach podczas biogenezy egzosomów (Nakase i Futaki, 2015). Zdolność do wykorzystania endogennych szlaków komórkowych do pakowania środków terapeutycznych poprawia skuteczność ładowania leków w porównaniu do metod bezpośrednich.
Skuteczność dostarczania leków przez nanonośniki egzosomowe zależy od ich zdolności do specyficznego oddziaływania z komórkami docelowymi. Aby zwiększyć ukierunkowanie na konkretną komórkę, naukowcy zaprojektowali powierzchnię egzosomu za pomocą ligandów, takich jak przeciwciała (Kamerkar i in., 2017), folian (Shtam i in., 2013) i peptydy penetrujące komórki (Alvarez-Erviti i in., 2011). Te ukierunkowane ugrupowania umożliwiają preferencyjną akumulację w miejscach chorobowych. Wykorzystanie białek rusztowania błonowego do wyświetlania ligandów może dodatkowo zwiększyć awidność egzosomów i biodystrybucję w porównaniu z chemicznymi metodami koniugacji (Zeelenberg i in., 2018). Alternatywnie, ekspresja białek fuzyjnych podczas biogenezy egzosomów pozwala na metaboliczne znakowanie błon pęcherzyków bez naruszania ich integralności. Takie techniki dekorowania zaprojektowanych egzosomów różnorodnymi ligandami docelowymi obiecują zwiększenie selektywnego ukierunkowania na komórki.
Przyszłość nanomedycyny egzosomowej
Egzosomy pojawiły się niedawno jako obiecujące biologiczne nanonośniki do dostarczania leków, biorąc pod uwagę ich biokompatybilność, niską immunogenność, zdolność do enkapsulacji różnych ładunków i wewnętrzne zdolności celowania. Nadal jednak trwają prace nad opracowaniem skalowalnych, wydajnych i zoptymalizowanych technik ładowania egzosomów cząsteczkami terapeutycznymi, profilaktycznymi i diagnostycznymi. Równolegle, ulepszenia bioinżynieryjne, takie jak trojanizacja powierzchni egzosomów za pomocą ligandów celujących, obiecują dostarczanie specyficzne dla komórek.
Wczesne badania przedkliniczne potwierdziły przydatność zmodyfikowanych egzosomów do modulowania szlaków wewnątrzkomórkowych w zwierzęcych modelach chorób. Dzięki niedawnym postępom w zakresie skalowalnej produkcji, oczyszczania i protokołów inżynieryjnych, nanomedycyny egzosomowe są gotowe do zastosowania klinicznego. Obecnie trwa badanie fazy I mające na celu ocenę bezpieczeństwa i skuteczności egzosomów pochodzących z komórek dendrytycznych w immunoterapii niedrobnokomórkowego raka płuc (Besse i in., 2016). Wyniki wczesnej fazy badań na ludziach rzucą światło na przyszłość zmodyfikowanych egzosomów jako wszechstronnych, opartych na komórkach nanoplatform do dostarczania leków. Wykorzystanie potencjału klinicznego nanonośników egzosomów może umożliwić ukierunkowane terapie, otwierając jednocześnie możliwości dla płynnych biopsji i diagnostyki zastępczej.
Źródła:
Alvarez-Erviti, L., Seow, Y., Yin, H., Betts, C., Lakhal, S., & Wood, M. J. (2011). Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nature biotechnology, 29(4), 341-345. https://www.nature.com/articles/nbt.1807
Besse, B., Charrier, M., Lapierre, V., Dansin, E., Lantz, O., Planchard, D., Le Chevalier, T., Livartoski, A., Barlesi, F., Laplanche, A. & Ploix, S. (2016). Dendritic cell-derived exosomes as maintenance immunotherapy after first line chemotherapy in NSCLC. OncoImmunology, 5(4), e1071008.
Colombo, M., Raposo, G., & Théry, C. (2014). Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual review of cell and developmental biology, 30, 255-289.
Haney, M. J., Klyachko, N. L., Zhao, Y., Gupta, R., Plotnikova, E. G., He, Z., Patel, T., Piroyan, A., Sokolsky, M., Kabanov, A. V., & Batrakova, E. V. (2015). Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release, 207, 18-30.
Heath, N., Grant, L., De Oliveira, C., Rowlinson, J., Osteikoetxea, X., Dekker, N., Overman, R., Barentsen, G., Lynch, A., Crescitelli, R. & Svensson, K. (2018). Rapid isolation and enrichment of extracellular vesicle preparations using anion exchange chromatography. Scientific reports, 8(1), 1-14.
Hwang, B., Lee, J. H., & Bang, D. (2019). Single-step generation of therapeutic exosomes with targeted cargo loading. Nature communications, 10(1), 1-12.
Jang, S. C., Kim, O. Y., Yoon, C. M., Choi, D. S., Roh, T. Y., Park, J., Nilsson, J., Lötvall, J., Kim, Y. K., & Gho, Y. S. (2013). Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS nano, 7(9), 7698-7710.
Kamerkar, S., LeBleu, V. S., Sugimoto, H., Yang, S., Ruivo, C. F., Melo, S. A., Lee, J. J., & Kalluri, R. (2017). Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreatic cancer. Nature, 546(7658), 498-503.
Nakase, I., & Futaki, S. (2015). Combined treatment with a pH-sensitive fusogenic peptide and cationic lipids achieves enhanced cytosolic delivery of exosomes. Scientific reports, 5(1), 1-8.
Ohno, S. I., Takanashi, M., Sudo, K., Ueda, S., Ishikawa, A., Matsuyama, N., Fujita, K., Mizutani, T., Ohgi, T., Ochiya, T. & Gotoh, N. (2013). Systemically injected exosomes targeted to EGFR deliver antitumor microRNA to breast cancer cells. Molecular therapy, 21(1), 185-191.
Shtam, T. A., Kovalev, R. A., Varfolomeeva, E. Y., Makarov, E. M., Kil, Y. V., & Filatov, M. V. (2013). Exosomes are natural carriers of exogenous siRNA to human cells in vitro. Cell communication and signaling, 11(1), 1-8.
Théry, C., Ostrowski, M., & Segura, E. (2009). Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature reviews immunology, 9(8), 581-593.Whiteside, T. L. (2016). Tumor-derived exosomes and their role in cancer progression. Advances in clinical chemistry, 74, 103-141.
Zeelenberg, I. S., Ostrowski, M., Krumeich, S., Bobrie, A., Jancic, C., Boissonnas, A., Delcayre, A., Le Pecq, J. B., Combes, F., Amigorena, S. & Théry, C. (2018). Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses. Cancer research, 78(4), 1228-1240.
Zhuang, X., Xiang, X., Grizzle, W., Sun, D., Zhang, S., Axtell, R. C., Ju, S., Mu, J., Zhang, L., Steinman, L. & Miller, D. (2011). Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain. Molecular therapy, 19(10), 1769-1779.