Egzosomy to bardzo małe, otoczone błoną pęcherzyki, które są wytwarzane i uwalniane przez komórki. Odgrywają one ważną rolę w komunikacji między komórkami i wykazano, że biorą udział w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych. W ostatnich miesiącach pojawiły się różnorodne produkty, wykorzystywane zarówno w kosmetologii, medycynie estetycznej, jak i klinicznej.
Bardzo ciekawym zagadnieniem, które ma wpływ na jakość dostępnych produktów i ich potencjalne zastosowanie jest sposób produkcji egzosomów.
Istnieje kilka różnych sposobów wytwarzania egzosomów, z których najważniejsze dwa to filtracja i wirowanie.
Filtracja jako metoda produkcji egzosomów
Filtracja to metoda oddzielania cząstek na podstawie ich wielkości przy użyciu filtra z porami o określonych wymiarach. Na „wejściu” do procesu mamy płyn biologiczny zawierający egzosomy (zazwyczaj płyn ten będzie pozyskany z hodowli namnażanych w kontrolowanych warunkach komórek macierzystych). Sam proces filtracji oparty jest o kaskadę filtrów z coraz to mniejszymi otworami w membranach. Pamiętać trzeba, że egzosomy to pęcherzyki o wymiarach w zakresie od 30 do 100 nanometrów (1 nanometr to milionowa część milimetra). To wielokrotnie mniej, niż wymiary komórek – stąd w pozyskanych metodą filtracji egzosomach w żaden sposób nie mogą być obecne zanieczyszczenia w postaci komórek właśnie.
Chromatografia wykluczania jako metoda produkcji egzosomów
Jedną z używanych do separacji egzosomów metod filtracji jest SEC (Size-exclusion chromatography) czyli chromatografia wykluczania, znana również jako chromatografia z filtracją żelową lub chromatografia z sitami molekularnymi. To metoda chromatograficzna, która oddziela cząsteczki na podstawie wielkości cząsteczkowej, stosowana szeroko w oczyszczaniu białek i charakteryzowaniu polimerów.
Kolumny do SEC umożliwiają rozdzielanie składników roztworów na podstawie rozmiaru cząsteczek – w pierwszej kolejności eluowane są większe cząsteczki. Separacja odbywa na zasadzie eliminacji cząstek o różnej wielkości w przestrzeni porów wypełnienia kolumny. Dostępne są kolumny SEC oparte na krzemionce i polimerach.
Jako fazę stacjonarną w SEC stosuje się porowatą matrycę, do której anality mają różny stopień dostępu. Duże cząsteczki są wykluczone z matrycy, więc zostaną wymyte jako pierwsze, podczas gdy małe cząsteczki, które są uwięzione przez pory, będą miały większy dostęp i zostaną wymyte później. Anality powinny mieć minimalne lub idealnie żadne oddziaływanie z powierzchnią fazy stacjonarnej, tak aby separacja opierała się wyłącznie na różnicy wielkości cząsteczek, a nie na oddziaływaniach chemicznych lub elektrostatycznych.
Kolejna metodą stosowaną w produkcji egzosomów jest wirowanie.
Wirowanie egzosomów
Wirowanie to metoda oddzielania cząstek na podstawie ich różnic w ich gęstości za pomocą urządzenia zwanego wirówką. Egzosomy można izolować z pożywek do hodowli komórkowych lub płynów biologicznych za pomocą metod wirowania, takich jak wirowanie różnicowe lub wirowanie w gradiencie sacharozy.
Wirowanie różnicowe to metoda oddzielania cząstek na podstawie ich wielkości i gęstości. Działa poprzez wirowanie próbki z dużą prędkością, co powoduje osadzanie się cięższych cząstek na dnie probówki, a lżejsze cząsteczki pozostają nadal zawieszone w roztworze. Egzosomy można odzyskać z supernatantu (cieczy na wierzchu osadu) za pomocą wirówki o wystarczająco dużej prędkości, aby osadzić większe, cięższe cząstki.
Wirowanie w gradiencie sacharozy to metoda oddzielania cząstek na podstawie ich wielkości i gęstości przy użyciu gradientu sacharozy, rodzaju cukru. Działa poprzez nakładanie próbki na gradient rosnących stężeń sacharozy w probówce, a następnie obracanie probówki z dużą prędkością. Cząstki będą osadzać się w gradiencie w zależności od ich wielkości i gęstości, przy czym mniejsze i lżejsze cząstki osadzają się na górze, a większe i cięższe cząstki osadzają się na dnie. Egzosomy można odzyskać z górnej warstwy gradientu za pomocą wirówki o wystarczająco dużej prędkości, aby osadzić większe, cięższe od nich cząstki.
Próbka zawierająca mieszaninę różnej wielkości makrocząsteczek jest układana na powierzchni gradientu, którego gęstość wzrasta liniowo z góry na dół. Podczas wirowania, różnej wielkości makrocząsteczki sedymentują przez gradient z różną szybkością. Szybkość sedymentacji zależy, oprócz siły odśrodkowej, od wielkości, kształtu i gęstości makrocząsteczek, jak również od gęstości i lepkości gradientu. W ten sposób makromolekuły są rozdzielane według wielkości, przy czym większe z nich sedymentują w kierunku dna, a lżejsze pozostają w pobliżu górnej części gradientu.
Egzosomy, ich zastosowanie i produkcja to wciąż obszar dynamicznego rozwoju. W nadchodzących miesiącach z pewnością będziemy świadkami pojawienia się jeszcze wielu innych rozwiązań technologicznych ułatwiających produkcje preparatów opartych o egzosomy.
Źródła informacji:
- Egzosomy jako pozakomórkowe wehikuły wykorzystywane do transfery leków: (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5539759/
- Izolacja i charakterystyka egzosomów: (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5801907/